Descrizione

Colorazione di Gram

La colorazione di Gram è il più importante metodo di colorazione differenziale per l’evidenziazione di specie batteriche. Il metodo è caratterizzato dall’utilizzo di 2 coloranti in successione: cristalvioletto e safranina.

Inizialmente il cristalvioletto viene fatto precipitare tramite una ossidazione con la soluzione iodio (lugol). Il complesso che ne deriva si fissa sulla partete cellulare batterica con legami di diversa natura e intensità. La soluzione differenziante elimina il complesso cristalvioletto – iodio dalla capsula di alcuni batteri ma non agisce su altri che rimangono colorati e si definiscono gram positivi. I batteri decolorati vengono poi evidenziati con un colorante di contrasto rosso e si definiscono Gram negativi. Si attribuisce la proprietà dei batteri Gram positivi a trattenere il complesso colorante – iodio al legame che si forma tra il complesso e una molecola presente solo nei Gram positivi: il magnesio ribonucleolato.

Colorazione di Gram Procedimento

1. Portare la sezione all’acqua distillata.
2. Versare la Safranina in una vaschetta verticale per istologia, introdurvi il vetrino ed incubare a 56-58 ° C per 15 minuti;
3. Lavare in acqua distillata.
4. Porre sulla sezione 10 gocce del Violetto: lasciare agire 3 minuti.
5. Sgocciolare il vetrino e, senza lavarlo, porvi 10 gocce dell’Iodio: lasciare agire 3 minuti.
6. Lavare in acqua distillata ed asciugare il vetrino prima in carta da filtro, poi all’aria per 10 minuti.
7. Versare il contenuto del del Decolorante in una vaschetta verticale per istologia: agitarvi il vetrino per 1 minuto;

RISULTATI DELLA COLORAZIONE DI GRAM

Batteri Gram-positivi blu

Batteri Gram-negativi rosso

Nuclei rosso

Colorazione di Gram relazione con la parete cellulare

La parete batterica è una struttura molto importante per la fisiologia del batterio e spesso anche per la sua azione patogena, si trova al di fuori della membrana cellulare e a volte può essere circondata da una capsula mucosa. Le sue funzioni vanno dal filtro per sostanze nutritive alla resistenza osmotica. Il componente fondamentale è formato da un enorme polimero chiamato peptidoglicano, la cui unià strutturale è formata da due carboidrati: l’N-acetil-glucosammina e l’acido N-acetil-muramico (NAG e NAM) incatenati tra loro (legami beta 1-6 e beta 1-4). Al NAM è legato inoltre un tetrapeptide in posizione 3. Immaginiamo una catena di NAG-NAM-NAG-NAM… disposta così come la vedete, la catena polipeptidica sarebbe legata al NAM verso il basso. In un piano diverso (mettiamo caso davanti a quella fila) ci sarebbe un’altra catena con le stesse caratteristiche. Cosa le collega? Molto spesso è una catena di glicine (rivolte in questo caso perpendicolare allo schermo). Questa è l’impalcatura essenziale della parete. Nelle tre dimensioni, nei Gram positivi (G+) questa catena forma uno strato compatto, moltiplicato per molti strati tenuti insieme da altre molecole come l’acido teicoico.

Il risultato è quello di avere una parete molto spessa, che fissa il cristal violetto della colorazione e che non permette la sua eliminazione con l’etanolo (clicca qui per la parete completa, qui per un batterio G+). Spesso ci si riferisce ai G+ anche come monodermi. Nei batteri Gram negativi (G-) invece, lo strato di peptidoglicano è molto sottile, e fa da divisore a due strati di fosfolipidi: quello della membrana plasmatica e quello della membrana esterna, e lo spazio compreso tra il peptidoglicano e la membrana plasmatica è chiamato spazio periplasmico. Nella membrana esterna sono presenti proteine, come le porine, e il lipopolisaccaride batterico (LPS). A volte la catena saccaridica (antigene-O) manca o è ridotta, in quel caso si parla di lipooligosaccaride (LOS).