Descrizione
Colorazione di Gram
La colorazione di Gram è il più importante metodo di colorazione differenziale per l’evidenziazione di specie batteriche. Il metodo è caratterizzato dall’utilizzo di 2 coloranti in successione: cristalvioletto e safranina.
Inizialmente il cristalvioletto viene fatto precipitare tramite una ossidazione con la soluzione iodio (lugol). Il complesso che ne deriva si fissa sulla partete cellulare batterica con legami di diversa natura e intensità. La soluzione differenziante elimina il complesso cristalvioletto – iodio dalla capsula di alcuni batteri ma non agisce su altri che rimangono colorati e si definiscono gram positivi. I batteri decolorati vengono poi evidenziati con un colorante di contrasto rosso e si definiscono Gram negativi. Si attribuisce la proprietà dei batteri Gram positivi a trattenere il complesso colorante – iodio al legame che si forma tra il complesso e una molecola presente solo nei Gram positivi: il magnesio ribonucleolato.
Colorazione di Gram Procedimento
- Portare la sezione all’acqua distillata.
- Versare la Safranina in una vaschetta verticale per istologia, introdurvi il vetrino ed incubare a 56-58 ° C per 15 minuti;
- Lavare in acqua distillata.
- Porre sulla sezione 10 gocce del Violetto: lasciare agire 3 minuti.
- Sgocciolare il vetrino e, senza lavarlo, porvi 10 gocce dell’Iodio: lasciare agire 3 minuti.
- Lavare in acqua distillata ed asciugare il vetrino prima in carta da filtro, poi all’aria per 10 minuti.
- Versare il contenuto del del Decolorante in una vaschetta verticale per istologia: agitarvi il vetrino per 1 minuto;
RISULTATI DELLA COLORAZIONE DI GRAM
Batteri Gram-positivi blu
Batteri Gram-negativi rosso
Nuclei rosso
Colorazione di Gram relazione con la parete cellulare
La parete batterica è una struttura molto importante per la fisiologia del batterio e spesso anche per la sua azione patogena, si trova al di fuori della membrana cellulare e a volte può essere circondata da una capsula mucosa. Le sue funzioni vanno dal filtro per sostanze nutritive alla resistenza osmotica. Il componente fondamentale è formato da un enorme polimero chiamato peptidoglicano, la cui unià strutturale è formata da due carboidrati: l’N-acetil-glucosammina e l’acido N-acetil-muramico (NAG e NAM) incatenati tra loro (legami beta 1-6 e beta 1-4). Al NAM è legato inoltre un tetrapeptide in posizione 3. Immaginiamo una catena di NAG-NAM-NAG-NAM… disposta così come la vedete, la catena polipeptidica sarebbe legata al NAM verso il basso. In un piano diverso (mettiamo caso davanti a quella fila) ci sarebbe un’altra catena con le stesse caratteristiche. Cosa le collega? Molto spesso è una catena di glicine (rivolte in questo caso perpendicolare allo schermo). Questa è l’impalcatura essenziale della parete. Nelle tre dimensioni, nei Gram positivi (G+) questa catena forma uno strato compatto, moltiplicato per molti strati tenuti insieme da altre molecole come l’acido teicoico.
Il risultato è quello di avere una parete molto spessa, che fissa il cristal violetto della colorazione e che non permette la sua eliminazione con l’etanolo (clicca qui per la parete completa, qui per un batterio G+). Spesso ci si riferisce ai G+ anche come monodermi. Nei batteri Gram negativi (G-) invece, lo strato di peptidoglicano è molto sottile, e fa da divisore a due strati di fosfolipidi: quello della membrana plasmatica e quello della membrana esterna, e lo spazio compreso tra il peptidoglicano e la membrana plasmatica è chiamato spazio periplasmico. Nella membrana esterna sono presenti proteine, come le porine, e il lipopolisaccaride batterico (LPS). A volte la catena saccaridica (antigene-O) manca o è ridotta, in quel caso si parla di lipooligosaccaride (LOS).
