Il Metodo Colorazione di Gram è il più importante metodo di colorazione batterica differenziale, ossia utilizza più coloranti usati in tempi successivi.
Il preparato contenente i batteri viene trattato con una soluzione di cristalvioletto per 2-3 minuti; quindi si allontana il colorante e si usa un mordenzatore, cioè una sostanza che permetta al colorante di legarsi in maniera stabile al substrato dato che, di solito, coloranti e strutture cellulari non hanno grande affinità.

Il mordenzatore utilizzato è una soluzione di iodio e ioduro di potassio in acqua, detta liquido di Lugol, che viene posto a contatto col preparato per 1 minuto.
A questo punto il preparato è trattato per 1-2 minuti con un decolorante (alcol etilico o acetone) e infine, ancora per altri 1-2 minuti, con un secondo colorante che può essere la fuxina o la safranina; questi coloranti conferiscono colore rosso facilmente differenziabile da quello del cristalvioletto che conferisce colore violetto.

Al termine della colorazione, alcuni batteri appaiono colorati in violetto perché il decolorante non è riuscito a rimuovere il complesso cristalvioletto-iodio da queste cellule; questi batteri sono definiti Gram-positivi. Altri batteri, invece, sono decolorati e pertanto assumono la colorazione del secondo colorante utilizzato, quindi appaiono rossi e sono definiti Gram-negativi.

Nel Metodo Colorazione di Gram l’idrofobicità della parete cellulare è alla base della caratteristica Gram-positività: mentre il cristalvioletto e lo iodio veicolato dalla soluzione di Lugol riescono a penetrare nella cellula attraversando la parete cellulare grazie alla loro idrofilia, il complesso colorante-iodio che si forma all’interno della cellula assume caratteristiche idrofobiche che non gli consentono di riattraversare la parete cellulare per essere estratto dalla cellula anche in presenza di decoloranti.