Citologia in Veterinaria: raccolta e preparazione dei campioni

I materiali utilizzati per la citologia in veterinaria includono tessuti solidi, sacche di liquidi, secrezioni o scariche di tessuti, versamenti di cavità corporee, urine, feci e lavaggi di tessuti. Il sito esterno viene pulito con una garza imbevuta di alcool o, preferibilmente, lavato con acqua calda e sapone antibatterico. L’aspirazione può essere con aspirazione o senza. Per l’aspirazione, una siringa da 6 o 12 ml è attaccata a un ago da 22 per masse fluttuanti morbide.

Un ago da 20 è preferenziale per la citologia in veterinaria per amplificare l’aspirazione in masse solide o dure composte da tessuto connettivo denso. La massa viene isolata e immobilizzata tra il pollice e l’indice. Posizionare l’ago al centro della massa se è piccolo (<2 cm). Per le grandi masse, il centro della lesione dovrebbe essere evitato per impedire l’aspirazione solo di materiale necrotico. Viene applicata l’aspirazione (da 3 a 5 ml) quando l’ago si trova all’interno della lesione, facendo avanzare l’ago due o tre volte in direzioni diverse. Dopo l’aspirazione, rilasciare delicatamente lo stantuffo per evitare di schizzare il materiale aspirato nel cilindro della siringa.

L’aspirazione potrebbe non essere nemmeno necessaria per ottenere un campione citologico diagnostico da alcuni tessuti, come linfonodi e sospetti tumori dei mastociti. Basato sul principio di capillarità, una tecnica denominata “campionamento capillare dell’ago sottile” richiede il posizionamento di un ago nella lesione senza la siringa attaccata. Un vantaggio è la minimizzazione della contaminazione del sangue e un altro è il ridotto rischio di rottura cellulare, entrambi comuni con la tecnica di aspirazione.

Il contenuto dell’ago potrebbe non essere visibile nel mozzo dell’ago. Vengono rimossi riempiendo di aria una siringa e spruzzando delicatamente una goccia di materiale su un vetrino. Una preparazione di zucca viene fatta premendo leggermente il materiale tra due diapositive mentre si fa scorrere in orizzontale.

I tessuti intatti devono essere prima assorbiti su carta assorbente per rimuovere il sangue in eccesso e i liquidi dei tessuti. Tocca delicatamente la diapositiva per creare un’impronta “asciutta”. Nel caso della pelle, la superficie è frequentemente contaminata da detriti, batteri e una risposta neutrofila, che potrebbe oscurare la vera patogenesi.

Fai degli strisci sottili distribuendo delicatamente i materiali sul vetrino. In un ambiente umido, i vetrini possono essere asciugati rapidamente all’aria. Non “fissare a caldo” le diapositive per citologia, in quanto questa procedura può danneggiare le cellule. Dopo aver preparato l’aspirato o l’impronta, asciugare all’aria i vetrini prima della colorazione.

Colorazione nella citologia in veterinaria

I vetrini devono essere colorati al più presto per evitare scarsi risultati di colorazione dovuti a variazioni del pH. Se la colorazione viene eseguita in un secondo momento, i vetrini devono essere collocati in un contenitore chiuso per proteggerli da insetti e luce.

Una volta che le diapositive vengono asciugate all’aria, possono essere colorate secondo i coloranti di Romanowsky. I coloranti rapidi sono le tecniche più utilizzate per le pratiche cliniche di valutazione citologica. Questi possono essere coloranti Wright  a base acquosa, come il Diff Stain Quick.

Il Reticolor è un’altra colorazione comune in aggiunta alle colorazione di Romanowsky discusse sopra che possono essere utilizzate per la citologia. È utilizzato anche per l’esame dei sedimenti urinari e per l’ematologia con identificazione dei corpi dei reticolociti o Heinz. Dal momento che è una macchia solubile in acqua, non dissolve i lipidi e può essere facilmente utilizzato per identificare lipomi e cristalli di colesterolo.

Anche i funghi, i batteri e i granuli dei mastociti sono facilmente visibili con questa macchia. In caso di forte contaminazione del sangue, le cellule nucleate sono meglio identificate utilizzando reticolor poiché i globuli rossi non si colorano bene. Un vetrino deve essere posizionato sopra la goccia di colorante e la diapositiva deve essere esaminata quando la colorazione viene applicata, in quanto evaporerà entro poche ore.

Citologia in veterinaria e microscopia

Gli artefatti si incontrano spesso durante l’esame citologico. Le ife fungine sono spesso confuse con le forme lineari formate da cellule fratturate che formano filamenti nucleari o streaming e da filamenti di fibrina con piastrine intrappolate. Colore, forma e uniforme della larghezza sono utili per fare questa distinzione. I batteri, il lievito o gli organismi di Rickettsia sono spesso erroneamente diagnosticati a causa del precipitato a seguito di un risciacquo inadeguato o con materiale di macchia vecchio che è stato contaminato.

Spore o frammenti di piante possono simulare funghi patogeni. Scarsi dettagli cellulari e colorazioni spesso derivano dal contatto diretto e indiretto dei campioni citologici con formalina, ad esempio, effettuando la preparazione citologica nella stessa stanza di un contenitore aperto di formalina,

Le interpretazioni citologiche sono generalmente classificate in uno dei cinque gruppi citodiagnostici. Viene fatta un’eccezione per i versamenti di cavità corporea che hanno le proprie categorie di classificazione. Le interpretazioni del materiale citologico possono includere più di una categoria, come l’infiammazione insieme a una risposta a lesioni ai tessuti o neoplasia insieme all’infiammazione.

Gruppi citodiagnostici

• Tessuto normale / iperplastico
• Massa cistica
• Risposta a lesioni tissutali
• Infiammazione
• Neoplasia

Tessuto normale/iperplastico

I tessuti normali e iperplastici sono composti principalmente da tipi di cellule mature. Cercare l’uniformità nelle dimensioni e nella forma cellulare, nucleare e nucleolare. Il volume del citoplasma è generalmente elevato rispetto al nucleo. L’iperplasia è un ingrossamento non neoplastico del tessuto che può verificarsi in relazione a disturbi ormonali o lesioni dei tessuti. Il tessuto iperplastico tende ad allargarsi simmetricamente rispetto alla neoplasia.

Citologicamente, le cellule iperplastiche hanno un rapporto nucleare/citoplasmatico (N:C) più elevato rispetto alle cellule normali. Ad esempio, l’epitelio delle ghiandole salivari normali appare come grandi cellule schiumose con nuclei condensati e un N:C basso. L’iperplasia prostatica osservata nei cani maschi intatti con una prostata simmetrica allargata ha un epitelio cuboidale di dimensioni uniformi e differenziazione comunemente con un N:C elevato.

Massa cistica

Le lesioni cistiche contengono materiale liquido o semisolido. Il liquido a basso contenuto proteico di solito contiene un piccolo numero di cellule. Queste lesioni benigne possono derivare dalla proliferazione delle cellule del rivestimento o da lesioni ai tessuti. Ad esempio, il sieroma è un fluido chiaro giallo chiaro che assomiglia al siero che può contenere rare grandi cellule mononucleate con granularità citoplasmatica. Una cisti follicolare è una massa cutanea comune in molte specie composta interamente da epitelio squamoso anucleato cheratinizzato spesso con cristalli di colesterolo rettangolari che si vedono meglio su uno sfondo proteico leggero o quando viene utilizzata la colorazione reticolor.

Risposta a lesioni tissutali

I cambiamenti comuni includono emorragia, detriti proteici, cristalli di colesterolo, necrosi o fibrosi. L’emorragia con presenza di eritrociti è patologica e deve essere distinta dalla contaminazione del sangue riscontrata durante la raccolta citologica. La contaminazione del sangue contiene numerose piastrine oltre agli eritrociti non affetti. L’emorragia acuta è associata all’inghiottimento degli eritrociti da parte dei macrofagi chiamati eritrofagi.

L’emorragia cronica è associata a macrofagi attivi contenenti pigmento del sangue degradato all’interno del loro citoplasma, ad esempio granuli di emosiderina da blu-verde a nero o cristalli di ematoidina romboidale gialla. L’emosiderina rappresenta un’eccessiva aggregazione di molecole di ferritina. Questa forma di ferro immagazzina macchie positive con la reazione blu di Prussia. Durante la scomposizione anaerobica dell’emoglobina possono formarsi cristalli di ematoidina che si verificano all’interno di tessuti o cavità e non contengono ferro. Gli ematomi spesso contengono eritrociti fagocitati se la lesione è acuta o macrofagi carichi di emosiderina se la lesione è cronica.

Detriti proteici possono apparire sullo sfondo del preparato. Ciò può includere muco che si colora leggermente da filamenti amorfi da basofili a viola. I corpi linfoglandolari sono frammenti citofasmatici basofili da cellule fragili. Lo streaming nucleare è un filo di materiale nucleare residuo che si colora dal rosa al viola. Lo stroma fibrovascolare appare come filamenti da chiari a rosa chiaro che spesso rappresentano il collagene e possono essere miscelati con cellule del fuso e endotelio. L’amiloide è una proteina non comune che è amorfa, eosinofila e ialinizzata e associata a infiammazione cronica.

Necrosi e fibrosi possono verificarsi insieme in alcuni preparati citologici. La morte delle cellule è rappresentata da contorni cellulari sfocati e indistinti e dalla scarsa definizione del tipo di cellula. La lesione accompagnatoria del tessuto è la risposta riparativa che comporta una maggiore attività fibroblastica. È comune vedere fibrociti molto reattivi insieme a una grave infiammazione e questo aspetto spesso imita una condizione neoplastica.

Infiammazione

Le condizioni infiammatorie sono classificate citologicamente in base alla predominanza o alla miscela del tipo di cellula coinvolta, quali neutrofili, macrofagi ed eosinofili.

Neoplasia

Il riconoscimento di condizioni benigne e maligne può essere difficile.

Categorie citomorfologiche di neoplasia.

Riferimenti:

• Baker R, Lumsden JH, Colour Atlas of Cytology of the Dog and Cat, Mosby, St. Louis; 2000.
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• Radin MJ, Wellman ML, Interpretation of Canine and Feline Cytology, Ralston Purina Company Clinical Handbook Series. The Gloyd Group, Inc, Wilmington, DE; 2001.
• Raskin RE, Meyer DJ (eds), Atlas of Canine and Feline Cytology, WB Saunders Co, Philadelphia; 2001.